1. 控制
在 为了区分样品的特定和非特异性条带 材料，始终对每个印迹运行对照，其中只有二次 应用不含一抗的抗体偶联物。
2.二抗稀释
这 二抗不应在过高浓度下使用。在 大多数应用中二抗可以很好地用于稀释 高于 1：10.00，而较高浓度可能有利于非特异性 后台绑定。作为指导原则，与彩色承印物相比 当ECL底物 使用。最佳稀释度也可能因不同批次的 二抗。
Western blotting的推荐稀释度：
• HRPO conjugates：1:5.000 – 1:100.000 (non-ECL) / 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)
• Alk. Phos. conjugates：1:5.000 – 1:50.000
• Biotin conjugates：1:20.000 – 1:400.000
• Streptavidin-HRPO：0,01 – 0,1 µg/ml
• Streptavidin-Alk.Phos：1 – 2 µg/ml
3.使用牛奶粉时的注意事项
牛 奶粉经常用作Western blotting中的封闭剂， 但有时它也可能是不需要的背景的来源。在 为了减少二抗的背景反应 牛Ig在奶粉中利用二抗吸附 对牛（MinX Bo）或人类（MinX Hu）Ig/血清蛋白是 推荐。
减少非特异性背景的其他措施包括用来自与二抗相同物种的 5% 正常血清或不含 IgG 的 BSA（货号 001-000-161 / 2）进行封闭。通常，改用正常血清作为封闭试剂可有效获得最干净的印迹结果。
一般来说，次要的 抗体应在不含蛋白质碱（如牛奶）的缓冲液中稀释 粉末A.O.为了排除二抗与 蛋白质补充剂中存在的免疫球蛋白或蛋白质。这是 对于抗山羊偶联物尤其重要（见4）。
4. 使用抗山羊偶联物时的注意事项
防山羊 来自宿主物种驴、兔和小鼠的二抗 与牛免疫球蛋白高度交叉反应，例如牛奶中的免疫球蛋白 粉。如果二抗稀释缓冲液含有奶粉， 几乎所有的反山羊偶联物都会被牛Ig吸附。 这会导致信号Wan全缺失或信号微弱，如果 共轭物以高浓度施用。此外，这些 如果牛奶粉 用于阻止。
为了检测蛋白质印迹上的山羊一抗，我们建议使用牛抗山羊（货号805-xx5-180）。在非常密切相关的宿主牛中产生抗山羊抗血清导致抗体与牛Ig /血清蛋白没有交叉反应性。
5. 样品裂解物中的内源性免疫球蛋白
如果 由SDS-PAGE分离的样品材料是 含免疫球蛋白的细胞或组织，无二抗 与样品相同的物质的交叉反应（MinX）应该是 使用。（或者，正常血清（Ig）的相同物种比 样品材料可以添加到二抗稀释缓冲液中。
6. 免疫沉淀后抗体的背景条带
在 下面的文章你可以阅读背景波段是如何引起的 使用时可避免在印迹膜上沉淀免疫球蛋白 用于蛋白质印迹检测的二抗。
免疫印迹（蛋白质印迹） – 避免抗体的背景条带
一 免疫印迹（蛋白质印迹）最Chang用的问题 用于间接检测的二抗是背景条带引起的 通过样品制备中的抗体来源于例如 免疫沉淀，裂解物中的细胞或组织自身免疫球蛋白或 牛免疫球蛋白污染（细胞裂解物中的FCS，BSA， 等）。从样品中开槽的抗体重链和轻链之后 分别在 50 kDa 和 25 kDa 下减小 SDS-PAGE 显示带。 在非还原条件下，γ 免疫球蛋白 （IgG） 显示 约150 kDa。
在免疫沉淀（IP）中，关注这个问题是最重要的;特别是在免疫沉淀之后，当目标蛋白预计在25kDa或50kDa范围内时，必须解决这个问题。
这 IP后抗体背景带问题Wan全可以 通过使用直接偶联的一抗来旁路 检测目标蛋白。然而，标记的一抗是 通常不可用，因此必须检测未共轭的原发性 与二抗偶联物。
一 防止抗体在印迹后被印迹的可能方法 免疫沉淀包括与蛋白 A/G 包被的交联抗体 磁珠或共价偶联抗体直接与处理过的磁珠。 然而，为了避免使用这种方法的抗体污染， 在非变性条件下洗脱抗原至关重要，因为 否则，变性抗体片段将用 抗原。
如果抗原上 使用非偶联的一抗和 标记的二抗，可以通过选择 某些要求下右二抗：
用于免疫沉淀和印迹检测的一抗：
1.来自不同的寄主物种。
背景 印迹膜上沉淀抗体的条带可通过以下方式避免 对物种无交叉反应（MinX）的二抗 沉淀抗体。
示例：用多克隆兔抗靶蛋白沉淀，用单克隆小鼠抗靶蛋白
检测印迹>二抗抗小鼠IgG（H + L）MinX兔等。（例如，第 115-035-146 类）。
蛋白质印迹无种间交叉反应的抗 IgG/M （H+L） 列表 在以下位置查找更多用于蛋白质印迹的抗 Ig（H+L） 特异性抗体： 二抗
2. 来自同一宿主物种，并且
a.具有不同的同种型。
由 选择针对 一抗抗体的子/类 识别 可以避免印迹膜上沉淀抗体。
示例： 用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白沉淀， 用单克隆小鼠 （IgG2a） 抗靶蛋白
>二抗抗小鼠 IgG2a（例如货号 115-035-206）检测印迹。
用于蛋白质印迹的抗 IgG 亚类和抗 IgM 特异性二抗列表
b.目标蛋白接近50 kDa。
针对小鼠IgG轻链的二抗不与小鼠IgG轻链（50kDa）的还原和变性重链（50kDa）反应 沉淀抗体。它们只与还原的变性光结合 沉淀抗体的链在印迹上（见图）和 用于检测的一抗的天然轻链。 因此，可以在没有 来自诱发抗体的干扰。只有一个抗体条带 轻链区域，但不在目标范围内 检测到蛋白质。
示例： 目标蛋白约50 kDa;使用单克隆小鼠沉淀 （IgG1）抗靶蛋白，用单克隆小鼠印迹检测 （IgG1） 抗靶蛋白
> 二抗抗小鼠 Ig/G 轻链（例如货号 115-035-174）。
c.目标蛋白接近25kDa。
针对小鼠IgG的Fc片段的二抗不与 沉淀抗体。它们只与减少的、变性的重物结合 印迹和重链上的沉淀抗体链和重链 用于检测的天然一抗。因此，25 kDa 可以在印迹膜上检测蛋白质，而不会受到 沉淀抗体。只有一个抗体条带在 重链，但不在目标蛋白质的范围内被标记。
示例：目标蛋白约 25 kDa;使用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白沉淀，用单克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白
>二抗抗小鼠IgG Fc（例如货号115-035-071）检测印迹。
用于蛋白质印迹的抗IgG Fc特异性二抗列表
注意：如果一抗在未还原的 形式以及目标蛋白是否与其大小等相关。可以显示 在SDS-PAGE中，可以在不减少试剂的情况下应用样品。 用于沉淀的一抗仅形成一种抗体 150 kDa的波段，不会干扰目标检测 超出此分子量范围的蛋白质。
